В чем сложность исправления мутации в гене? Помимо того, что молекулярно-генетическую причину заболевания надо сначала обнаружить, что не всегда просто, у человека примерно 30 000 генов, взрослый человек состоит в среднем из 4 триллионов клеток, некоторые из них ежедневно обновляются. Для полного «исцеления» нужно исправить мутацию в каждой клетке организма и при этом не «испортить» другие гены. Тут и начинаются сложности.
Первая задача — это сам механизм исправления гена. Для исправления генетической «ошибки», приводящей к заболеванию, нужны весьма специфические инструменты — молекулярные «ножницы», которые разрежут ДНК в строго указанном месте, и «пинцет», который вместо вырезанного фрагмента с ошибкой вставит правильный кусок ДНК. Вся система клетки направлена на сохранение генетической информации в неизменном виде. ДНК, которая является материальным носителем этой информации, сама по себе в клетке не работает — это инструкция по построению разных функциональных молекул и их применению. Это значит, что любая попытка внести изменения в ДНК воспринимается клеткой как нападение, от которого она может защищаться разными способами. Некоторые вирусы научились встраиваться в ДНК человека в обход этой защиты. Их инструменты можно использовать для привнесения в ДНК клетки здорового гена целиком, с которого будет синтезироваться правильно работающий белок. Однако вирусы не заботятся о том, чтобы не испортить другие гены в чужом геноме при встройке, поэтому такой метод исправления мутаций может быть опасен нарушением других, здоровых генов.
Еще есть специальные системы внутри клетки, которые помогают разным белкам, работающим с ДНК, находить нужные гены, за цельностью длинных молекул ДНК и т.д. Эти белки умеют распознавать определенную последовательность нуклеотидов, то есть их можно настроить так, чтобы они работали с высокой точностью только с тем участком, который нужно исправить. Однако проблема таких молекулярных ножниц заключается в том, что они очень большие и доставить их в клетки организма человека очень сложно.
Самая остроумная и относительно простая для применения идея направляемых «молекулярных ножниц» основана на использовании свойств защитной системы бактерий. Еще в 1987 году в ДНК бактерий нашли необычные последовательности, которые позже назовут CRISPR-кассетами. Однако на тот момент разобрать их структуру и понять функцию не удалось. До 2006 года эти последовательности активно использовали для классификации бактерий, так как они значительно различаются не только между видами, но даже между штаммами — они были своеобразными генетическими карточками каждого бактериального штамма. В 2006 году, объединив данные о структуре CRISPR-кассет и ассоциированных с ними белков Cas , исследователи поняли функцию всей этой системы, а также механизм ее работы [1]. CRISPR/Cas система бактерий — это защитный механизм, предохраняющий одноклеточный организм от проникновения чужой ДНК. В ДНК CRISPR-кассеты хранится информация о вирусах, которые раньше попадались этой бактерии или ее предкам, в виде небольших фрагментов ДНК этих вирусов. С помощью этих фрагментов клетка вырабатывает сигнальные РНК, распознающие проникшую вирусную ДНК и указывающие на нее cas-белкам, которые разрежут ее на небольшие безопасные для клетки куски. Получается, что эта система позволяет разрезать ДНК, но только в определенном месте, которое укажут небольшие молекулы РНК. При использовании этого механизма для исправления мутации в клетку человека нужно доставить лишь небольшой (по сравнению с описанными выше собственными белками клетки) белок cas9 и «руководящую» РНК, которая укажет место мутации. CRISPR/Cas технология получила широкое распространение и стремительно развивается, поэтому белков группы cas разработано уже несколько и для каждого из них существует несколько модификаций. Второй задачей «починки» гена является доставка инструментов до всех клеток, чтобы исправить ошибку в каждой клетке организма. К этой задаче подходят с двух сторон. С одной стороны, в каждом типе клеток каждого органа работают разные гены. Это значит, что исправлять ген нужно не во всех клетках организма, а только в тех, в которых этот ген необходим для полноценного выполнения функций ткани или органа. Такой подход значительно ограничивает количество клеток, в которые нужно доставить инструментарий и позволяет подобрать наиболее эффективный способ в зависимости от особенностей этих клеток, тканей, органов. С другой стороны, наш организм изначально развивается из одной клетки и на ранних этапах развития эмбрион состоит всего из нескольких клеток. И если внести изменение на таком этапе, то с высокой эффективностью можно получить эмбрион с исправленной мутацией во всех клетках, а значит из него вырастет здоровый человек. В 2015 году исследователи из Китая представили результаты работы, в которой описали применение CRISPR/Cas9 для исправления точечной мутации в гене HBB, вызывающей β-талассемию, и мутации в гене G6PD, связанной с развитием дефицита глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, на самой ранней стадии развития эмбриона — в зиготе (оплодотворенная яйцеклетка, из которой развивается эмбрион). В 2017 году британские ученые подтвердили возможность редактирования генома эмбрионов человека на стадии бластоцисты (на 5-6 день развития). Важно понимать, что общемировая законодательная практика запрещает проводить эксперименты на человеческих эмбрионах более поздних стадий развития и имплантировать экспериментальные эмбрионы в матку для развития беременности. Тем не менее, в 2018 году китайский исследователь Хэ Дзянкуй объявил о рождении двойняшек из геноредактированных эмбрионов.
Подробности эксперимента и всех процедур не были опубликованы в научно-исследовательских журналах, общественности доступны лишь рассказы самого ученого, а так же отчеты государственных комиссий в сокращенном виде [2]. Известно, что для эксперимента были выбраны пары, в которых партнер являлся носителем вируса ВИЧ, а партнерша – нет, а целью являлось рождение детей, устойчивых к заражению этим вирусом. Устойчивость предполагалось привнести за счет редактирования у эмбрионов гена CCR5, небольшая делеция в котором может приводить к снижению возможностей вируса ВИЧ заражать целевые клетки. Такая делеция встречается в некоторых популяциях людей, и те, у кого копии гена с делецией представлены на обеих хромосомах, имеют сниженные риски заражения ВИЧ.
Результаты были представлены только на конференции в 2018 году. Редактирование генома пошло не по плану и привело к таким изменениям в гене CCR5, которые не встречаются в природе. При этом модификация произошла только в части клеток обоих эмбрионов и по-разному: в одном из них изменениями была затронута только одна из гомологичных хромосом (гетерозигота), а в другом — обе (гомозигота). Также было заявлено, что весь остальной геном не был затронут, хотя подробностей о методах проверки предоставлено не было. Это исследование вызвало шок и ярость как у ученых, так и у общественности.
С одной стороны, само исследование вызывало недоверие с технической точки зрения: Хэ Дзянкуй не имел опубликованных ранее исследований по этой теме, результат эксперимента не был оправдан с медицинской точки зрения, представленные молекулярно-генетические данные не отвечали даже общебиологическим стандартам качества проведения исследований. Медицинская польза от этого мероприятия очень сомнительна, так как ВИЧ может проникать в клетку с помощью других белков кроме CCR5, поэтому предсказать приобретаемую таким образом устойчивость к заражению невозможно, особенно если учесть мозаичность полученных эмбрионов [3].
Другая сторона — этическая. При редактировании генома на уровне эмбрионов воздействию подвергаются и те клетки, из которых получится человек (соматические), и те, из которых получатся дети этого человека (репродуктивные). Таким образом, внесенное изменение может передаваться из поколения в поколение и иметь значительный эффект в отдаленной перспективе. Еще один важный момент: функция гена CCR5 недостаточно изучена. Есть данные, что он участвует в некоторых процессах головного мозга, поэтому внесение в него искусственных изменений может обернуться появлением новых заболеваний или осложнений или особенностей [4]. До 2,3% людей встречаются в популяции с неактивным геном CCR5 и они взрослые, относительно здоровые и благополучные . Но нет информации о том, как этот ген и мутации в нем могут быть связаны с частотой потери беременности, детской смертности, с продолжительностью жизни [2]. Еще одна этическая проблема относится к возможности появления так называемых «дизайнерских детей», так как установить границы дозволенного к исправлению довольно сложно и можно быстро перейти от просто здоровых детей к детям с заданными параметрами. Особенно если учесть, что можно создавать несуществующие в природе генные конструкты. В конце концов, Хэ Дзянкуй нарушил закон, поэтому был осужден на 3 года лишения свободы и запретом на профессиональную деятельность во вспомогательных репродуктивных технологиях. Сейчас он работает в лаборатории генной терапии и надеется в скором времени вылечить более 200 пациентов от миодистрофии Дюшенна [5]. В России также проводятся исследования по возможной терапии моногенных заболеваний на ранних стадиях развития эмбриона, однако опубликованных данных об успешном проведении таких экспериментов пока нет [6].
Greely HT. CRISPR’d babies: human germline genome editing in the ‘He Jiankui affair’. J Law Biosci. 2019 Aug 13;6(1):111-183. doi: 10.1093/jlb/lsz010. PMID: 31666967; PMCID: PMC6813942.
Tsutomu Murakami and Naoki Yamamoto, Role of CXCR4 in HIV infection and its potential as a therapeutic target, 5 Future Microbiology 1025, 1039 (2010).
Lin J, Xu Y, Guo P, Chen YJ, Zhou J, Xia M, Tan B, Liu X, Feng H, Chen Y. CCL5/CCR5-mediated peripheral inflammation exacerbates blood‒brain barrier disruption after intracerebral hemorrhage in mice. J Transl Med. 2023 Mar 14;21(1):196. doi: 10.1186/s12967-023-04044-3. PMID: 36918921; PMCID: PMC10015963.
В 2015 году исследователи из Китая представили результаты работы, в которой описали применение CRISPR/Cas9 для исправления точечной мутации в гене HBB, вызывающей β-талассемию, и мутации в гене G6PD, связанной с развитием дефицита глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, на самой ранней стадии развития эмбриона — в зиготе (оплодотворенная яйцеклетка, из которой развивается эмбрион). В 2017 году британские ученые подтвердили возможность редактирования генома эмбрионов человека на стадии бластоцисты (на 5-6 день развития). Важно понимать, что общемировая законодательная практика запрещает проводить эксперименты на человеческих эмбрионах более поздних стадий развития и имплантировать экспериментальные эмбрионы в матку для развития беременности. Тем не менее, в 2018 году китайский исследователь Хэ Дзянкуй объявил о рождении двойняшек из геноредактированных эмбрионов.
