30′16
Авг

Как разрабатываются диагностические панели Genetico

Одним из важных направлений работы лаборатории Genetico является разработка скрининговых генетических тестов и проведение генетических анализов на их основе. При создании любых скрининговых тестов одним из главных аспектов является технология, на основе которой разрабатывается тест. Эта статья расскажет Вам, какую технологию использует наша лаборатория и как мы подходим к разработке своих тестов, почему получаемые результаты полностью достоверны, а сочетание цены и качества такого теста самое приемлемое.

Во-первых, следует разобраться, что такое скрининговые анализы. Это такие анализы, которые позволяют быстро и сравнительно легко, за счет использования одной методики, получить результаты по нескольким интересующим параметрам за раз. В случае генетического скрининга параметры – это наличие/отсутствие определенных мутаций. Набор мутаций (панель), которые идентифицируется по результатам теста, — это основа информативности скрининга. Дело в том, что мутации необходимо выбирать по двум основным признакам:

клиническая значимость, то есть действительно ли наличие мутации вызывает какие-то нарушения работы организма и/или заболевания,

частота мутации в популяции, для которой готовится панель.

Если какая-то мутация встречается редко, но вызывает серьезное заболевание, и даже носительство этой мутации может быть потенциально опасно, то это веская причина включить ее в набор анализируемых мутаций. С другой стороны, некоторые мутации и связанные с ними заболевания встречаются настолько редко в определенной группе людей, что включать их в скрининговый анализ неэффективно – вероятность, что попадется хотя бы один носитель, очень мала, в то время как ее можно заменить более частой, а потому более информативной мутацией. Таким образом, первым этапом создания эффективной в условиях российской популяции скрининговой панели является работа с опубликованными научными данными для поиска мутаций, связанных с заболеваниями и относительно часто встречающихся в российской популяции. Итак, в случае панелей лаборатории Genetico параметром, который определяется скрининговым анализом, является наличие/отсутствие мутаций в разных генах, а общая методика – это анализ продуктов Полимеразно-Цепной Реакции (ПЦР).

С этого момента следует перейти к «во-вторых» и приступить к разбору технологии, которую мы используем в своих тестах. В клетках любого животного перед делением, то есть размножением, клетки обязательно удваивается количество ДНК, так как в каждую из двух клеток, получающихся после деления, должен попасть такой же набор генетической информации, какой был у клетки-родителя. Это удвоение происходит за счет того, что специальный комплекс из большого количества белков, взаимодействующих разнообразными способами, постепенно от начала и до конца проходит каждую молекулу родительской ДНК, выстраивая в точно такую же последовательность отдельные нуклеотиды и соединяя их между собой – получается вторая точно такая же молекула. Этот комплекс белков называется ДНК-полимеразой. Оказалось, что подобный процесс можно проделать и в пробирке, хотя для этого нужны некоторые ухищрения. Интересно, что за это открытие, в 1993 году была получена Нобелевская премия по химии. При этом в пробирке, то есть в искусственных условиях, такое увеличение количества ДНК можно направить, то есть удваивать не все молекулы ДНК и не по всей длине, а только определенный участок. Для этого необходимо знать последовательность ДНК участка, который будем нарабатывать с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), и подобрать специальные затравки (они называются праймерами), чтобы указать полимеразе, откуда начинать построение копии ДНК и где закончить. Итак, вторым этапом подготовки нашего теста является подбор этих самых затравок для каждого участка ДНК, на котором проверяется наличие мутации.

На третьем этапе нужно понять, как идентифицировать саму мутацию. То есть, как различить полученные в результате ПЦР кусочки ДНК, ведь мутации иногда бывают в изменении всего лишь одного нуклеотида. Для этого используют специальные зонды – они взаимодействуют с ДНК и светятся определенным цветом. Одновременно в пробирке находятся: наработанные в ПЦР кусочки, которые мы должны отнести к мутантным или немутантным, и два зонда. Один из них может соединиться только с нормальной ДНК и если соединяется, то дает зеленый свет (в прямом смысле слова будет светиться зеленым, но только чувствительный прибор сможет «увидеть» это свечение). Другой зонд может соединиться только с мутантной молекулой ДНК и при соединении с ней давать красный свет. Получается, что если в пробирке только нормальные кусочки ДНК, то свет от нее будет только зеленый, а если только мутантные — только красный. Если же изначально образец был взят у гетерозиготы по этой мутации, то пробирка будет светиться примерно 50:50 в зеленом и красном спектре. Подбор этих зондов и является третьим и очень ответственным этапом разработки теста. На этом этапе также важно убедиться, что подобранные зонды позволяют однозначно различить мутантные и нормальные молекулы ДНК – для этого проводятся проверка их работы в «полевых» условиях, то есть в пробирке на образцах ДНК.

Теперь разберемся, зачем вообще нужно увеличивать количество ДНК с помощью ПЦР. Ведь мы можем добавить зонды сразу в образец ДНК, они соединятся/не соединятся и будут светиться определенным цветом. Дело в том, что приборы, выявляющие степень свечения, имеют ограничения по тому, насколько малый уровень сигнала они могут уловить. И оказывается, что ДНК, выделенной из образца 5 мл крови, недостаточно, чтобы сигнал от конкретного участка был достаточно сильным. Плюс к этому, мы нарабатываем именно нужный для анализа участок ДНК, поэтому убирается ошибочный сигнал из-за случайного взаимодействия зондов с неинформативными для анализа участками ДНК.

Таким образом, общая схема анализа с помощью скрининговой панели такова: забор биологического материала – выделение ДНК из этого образца – постановка ПЦР для увеличения количества нужного участка ДНК – идентификация мутации с помощью светящихся зондов. Однако в случае панелей конкретика очень важна. А именно, что позволяет проводить анализ сразу на несколько мутаций и использовать для этого минимальное количество образца.

В лаборатории Genetico для проведения анализа по панелям мы используем технологию Fluidigm. Она основана на проведении ПЦР в очень маленьких объемах (меньше 0,2 микролитров). Это позволяет, с одной стороны, использовать минимальное количество ДНК и, с другой стороны, одновременно проводить анализ 48 мутаций для 45 образцов. То есть за один раз можно узнать информацию по 48*45=2160 точкам. Эта технология удивительна по своей простоте и эффективности. Каждый маркер (смесь затравок-праймеров и зондов, нужных для идентификации одной мутации)мы наносим вручную только один раз в специальную лунку, так же как и каждый образец – в другую лунку. А вот получение отдельной смеси образца с каждым из маркеров происходит с помощью микроканалов в маленьких-маленьких лунках (они обозначены на картинке). В каждой микролунке происходит отдельная ПЦР, продукты которой светятся зеленым или красным. Мы знаем в какой лунке какой образец с каким маркером смешан, поэтому можем сделать вывод о генотипе каждого образца по каждому маркеру.

Важным аспектом в любом количественном измерении является контроль. Вдруг забыли что-то добавить, или какой-то реагент испортился, или ДНК в образце было недостаточно. Для этого мы в каждом анализе используем ряд положительных и отрицательных контролей. Отрицательный контроль (в нем отсутствует ДНК, поэтому правильно, когда в таких точках нет никакого свечения, так как зондам не с чем связываться) задает фоновый уровень свечения, который берется в измерении за относительный ноль. Такой контроль необходим для отслеживания чистоты помещений и растворов от случайной ДНК, чтобы исключить возможность ложноположительных результатов. Положительных контролей всегда три. Их мы готовим специальным образом: для каждой мутации искусственно синтезируется отдельно молекула ДНК без мутации и с ней. Для положительного контроля нормальной гомозиготы по всем мутациями смешиваются все 48 синтезированных молекул с нормальными последовательностями. Тогда получается искусственно созданный образец, который по всем исследуемым мутациями будет заведомо нормальной гомозиготой. Для контроля мутантных гомозигот формируется подобная смесь из мутантных молекул ДНК по всем анализируемым мутациям. Для гетерозиготного контроля смешивается в соотношении 1:1 молекулы с мутациями и без мутаций по каждой мутации. Такие синтетические положительные контроли получить сложнее, чем просто взять образец ДНК человека, который оказался, например, нормальной гомозиготой, но они дают более точное контрольное значение. Значение исследуемого маркера в образце сравнивают со значением каждого из трех контролей и, соответственно, относят к гетерозиготе или одной из гомозигот.

После полной разработки панели и положительных контролей для нее, необходимо проверить ее точность и эффективность. Для этого проводят анализ сотни-двух образцов с помощью разработанного скринингового анализа и с помощью другого менее удобного и часто дорогостоящего метода. Результаты, полученные обоими методами, должны совпасть по всем образцам. Так же на этом этапе мы можем определить, насколько включенные в панель мутации информативны в условиях России. Дело в том, что научные данные о частоте разных мутаций в российской популяции в большинстве случаев отсутствуют, поэтому на первом этапе разработки теста мы руководствуемся данными по европейской популяции. Потом мы делаем предварительную оценку по частоте мутаций именно в России, по тем данным, которые получили в ходе работ по разработке панели. Как упоминалось выше, это важно для повышения ее эффективности – если какая-то мутация встречается крайне редко, то лучше ее заменить на другую, более частую, так как размер панели ограничен. Однако наша работа по разработке генетического теста не заканчивается на его выпуске для клинического использования. Научная информация в нашей лаборатории и во всем мире каждый день пополняется, поэтому мы постоянно мониторим полученные по нашим клиническим данным частоты мутаций, дорабатывая таким образом эффективность панелей; следим за появлением в научных статьях данных о новых клинически значимых мутациях и можем добавлять их в наш анализ. Кстати, сданный Вами генетический тест приносит пользу не только Вам, но и пополняет немногочисленную, к сожалению, на сегодняшний день информацию о россиянах, помогает развивать фундаментальную и прикладную популяционную генетику и медицину. Конечно, только в том случае, если Вы подписали документ о том, что согласны с использованием ваших данных в исследовательских целях.

Таким образом достигается высокая точность, информативность и эффективность всех разрабатываемых лабораторией Genetico скрининговых диагностических тестов. Интересно отметить, что высокопроизводительную технологию Fluidigm и систему из синтетических контролей для генетического анализа в России использует только наша компания. О том, кому необходимо сдавать такие анализы и о чем расскажут результаты, вы можете посмотреть на странице соответствующей услуги на нашем сайте.

*для лучшего понимания текста можно ознакомиться с основными генетическими терминами.

Автор: Жикривецкая Светлана

Биолог-исследователь