fbpx

Что такое секвенирование?

23 ноября 2022 г

Содержание:


Хранителями наследственной информации в организме являются клетки ДНК и особое значение имеет порядок нуклеотидов в них. В числе других общеизвестных фактов — форма двойной спирали, которую имеет молекула ДНК.

Эти знания кажутся рядовыми, а ведь не так давно они были недоступны человечеству. Подробное описание молекулы ДНК появилось лишь в 1953 году, а впервые секвенировать геном получилось в 2001 году. Ниже мы чуть подробнее остановимся на истории генетики – раздела биологии, занимающегося изучением генов, генетических вариаций и наследственности в организмах и ее практической пользе.

Немного истории

Впервые «нуклеин», ранее неизвестное вещество, состоящее из фосфора и азота, был выделен в 1869 году швейцарским врачом Иоганном Мишером. А чуть позже, основываясь на его свойствах, он уточнил, что это кислота. К началу ХХ века возникли различные гипотезы о молекуле ДНК, в основе которых лежало представление о ней как о комбинации 4 нуклеиновых кислот. На тот момент не было понимания того, как она используется в организме.

Исследования продолжались, и микробиологи пристально изучали свойства ДНК и РНК. К середине 1940-х годов ДНК рассматривалась как «генетическая библиотека». Параллельно ученые пытались определить структуру белков. И первым, кто смог их секвенировать, стал Фредерик Сенгер, дважды в истории ставший нобелиатом по химии.

Изучая инсулин, он стал разделять его на отдельные аминокислоты с помощью специальных реагентов. И уже через 8 лет Сенгер смог расшифровать структуру и порядок составных частей инсулина. Открытие было удостоено Нобелевской премии, а сам метод получил имя химика.
Разбирать же РНК и в особенности ДНК оказалось гораздо сложнее. Геном первых бактерий был расшифрован в 1995 году, а прочитать все гены человека получилось лишь в феврале 2001.

Что такое ДНК?

Физически дезоксирибонуклеиновая кислота — это макромолекула, которая хранит в себе наследственную информацию и, по сути, является подробной инструкцией по развитию организма в целом. Она имеет спиральную структуру, которая состоит:

  • из нуклеотидов — базовых структурных элементов;
  • двух цепочек генов, закрученных в спираль.

Каждая цепочка включает в себя 4 разновидности нуклеотидов: тимин, аденин, цитозин и гуанин, в которых и происходит запись всей наследственной информации. Причем обе нити закручиваются в спираль не хаотично. Из всех 4 нуклеотидов находиться напротив друг друга в разных цепочках они могут только двумя парами: гуанин-цитозин и аденин-тимин. Эти пары называются комплементарными.

Между парными нуклеотидами возникает устойчивая водородная связь. Причем у аденина-тимина она несколько слабее, чем у гуанина-цитозина. Тем не менее скручивание в спираль позволяет уменьшить длину нити генов вплоть до 6 раз. А в случае со суперспирализацией — до целых 30 раз. Все это подтверждает тот факт, что спиральность как таковая служит для того, чтобы компактнее уложить в клетку всю наследственную информацию.

Что понимают под генетическим секвенированием?

Под секвенированием подразумевают несколько методов, цель которых — определение нуклеотидной последовательности в ДНК. На данный момент нет ни одного способа, который бы работал для этой макромолекулы целиком. Все они устроены одинаково: сначала ДНК многократно клонируется и рассекается в случайных местах, а затем каждый такой участок читается по-отдельности.

Клонирование выполняется либо выращиванием клеток в чашке Петри, либо при помощи полимеразной цепной реакции. В кратком виде, независимо от метода секвенирования, оно выглядит так:

  • денатурация ДНК — то есть разрушение водородных связей, чтобы получить отдельные цепочки;
  • присоединение праймеров — коротких фрагментов ДНК, к которым может присоединиться ДНК-полимераза непосредственно для репликации нитей;
  • копирование полимеразой дезоксирибонуклеиновой кислоты;
  • повторение процесса.

Все эффекты достигаются за счет изменения температуры смеси из праймеров, ДНК и полимеразы. Процесс отличается точностью и исключает ошибки, при этом на выходе получается множество копий участков одной и той же дезоксирибонуклеиновой кислоты. Прочитать их можно несколькими способами.

Методы секвенирования

Первым способом обработки целых геномов стал так называемый Sanger sequencing. Методика секвенирования по Сенгеру предполагала использование ДНК-полимеразы и радиоактивно меченых нуклеотидов. С течением времени она прошла несколько модификаций, в числе которых «плюс-минус» и «обрыв цепи», и долгое время считался «золотым» стандартом. К категории методов «старого поколения» также стоит отнести и химическую деградацию, предложенную Максамом и Гилбертом, но не получившую распространения по причине быстрого развития энзимологии.

Сегодня уже разработаны и активно развиваются новые технологии для определения последовательности ДНК:

  • пиросеквенирование, основанное на принципе синтеза и регистрации пирофосфата, образующегося при присоединении ДНК-полимеразой очередного нуклеотида;
  • секвенирование на молекулярных кластерах, также подразумевающее синтез новой молекулы ДНК по матрице;
  • SMRT, построенное на наблюдении в реальном времени за работой единичной молекулы ДНК-полимеразы;
  • SOLiD, базирующееся на методе лигирования;
  • ионное полупроводниковое секвенирование, в основе которого обнаружение ионов водорода, выделяющихся во время полимеризации ДНК.

В их основе лежит стремление к автоматизации , увеличению объема получаемых сведений и удешевлению процесса. Появление метода NGS (next generation sequencing) позволило ускорить выявление полной последовательности миллионов геномов, единовременно оценить работу тысяч генов в тканях, организмах и отдельных клетках.

В настоящий момент NGS-метод применяется в рамках анализа:
Генома — анализ всего наследственного материала клетки организма. Дорогостоящая процедура, востребованная в случае, если другие методы оказались неэффективны.
Экзома — секвенирование части генома (1%), отвечающей за синтез белка. До 85 % от всех мутаций, связанных с болезнями, составляют именно поломки в экзоме. Наиболее распространенный тип исследования.
В рамках исследования проводится определение возможных генетических причин различных заболеваний. Наиболее часто применяются в диагностике наследственных эпилепсий, аутизма, обмена веществ, нервно-мышечных и нейродегенеративных заболеваний и др.

Применение

В первую очередь, секвенирование может служить надежным инструментом для выявления причин наследственных патологий. Анализ универсальный и позволяет наряду с генами или их участками читать и митохондриальную ДНК.

Кроме того, метод может использоваться при планировании семьи в качестве скрининга на носительство патогенных мутаций в одном и том же гене у родителей, что ведет к рождению ребенка с рецессивным заболеванием. Полногеномное и полноэкзомное секвенирование также позволяет получить сведения о мутациях в генах, связанных с развитием рака яичников или молочной железы.

Глубина анализа генома выше, чем у таких масштабных современных исследований, как, к примеру, экзомное секвенирование, ввиду охвата всей последовательности ДНК. Но отличия в клинической эффективности от того же экзома не в разы, а на несколько процентов. Поэтому в большей степени сегодня выбор типа исследования осуществляется на усмотрение врача, а также пациента, который хочет получить максимум информации на будущее.

Секвенирование ДНК
Секвенирование ДНК нового поколения (Next Generation Sequencing) на современном оборудовании в короткие сроки.

Перейти к услуге

Список используемой литературы:

    1. Phillip E. C. Compeau, Pavel A. Pevzner. Genome Reconstruction: A Puzzle with a Billion Pieces. In Bioinformatics for Biologists.
    2. M.Chaisson, P. Pevzner, H. Tang. Fragment assembly with short reads. Bioinformatics 20 (13): 2067-2074, 2004.
    3. M.C. Schatz, A.L. Delcher, S. Salzberg. Assembly of large genomes using second-generation sequencing. Genome Research, 20(9):1165-1173, 2010.
    4. Donald Sharon, Hagen Tilgner, Fabian Grubert, Michael Snyder. (2013). A single-molecule long-read survey of the human transcriptome. Nat Biotechnol. 31, 1009-1014.
    5. J. Eid, A. Fehr, J. Gray, K. Luong, J. Lyle, et. al.. (2009). Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323, 133-138.
Закрыть




    ОнлайнВ центре



            Отправляя форму, вы даете согласие на обработку и хранение персональных данных в соответствии с пользовательским соглашением












                Отправляя форму, вы даете согласие на обработку и хранение персональных данных в соответствии с пользовательским соглашением








                  Отправляя форму, вы даете согласие на обработку и хранение персональных данных в соответствии с пользовательским соглашением








                        Ваше имя (обязательно)

                        Ваш e-mail (обязательно)

                        Тема

                        Сообщение