Секвенирование РНК и ДНК относится к рутинным процессам, но играет важную роль в расшифровке генома. И если изначально оно было доступно только узкому кругу лиц, то сегодня подобную услугу оказывает большинство лабораторий. А это с каждым годом открывает все больше возможностей для получения подробной геномной, транскриптомной и эпигеномной информации.
Открытию нуклеиновых кислот уже больше 150 лет. И заслуга принадлежит Иоганну Фридриху Мишеру, который в 1869 году выделил из присутствовавших в гное клеток незнакомое вещество, состоящее из фосфора и азота, и назвал его нуклеином. А спустя некоторое время, опираясь на его свойства, переименовал в нуклеиновую кислоту (НК).
Изначально придерживались мнения, что ее молекулы служат резервом фосфора в клетках. Но уже в первой половине ХХ века учеными была доказана их наследственная природа. В это же время появилось и понятие гена как мельчайшей функциональной и структурной единицы наследственности, а вслед за этим сформировалась и сама наука — генетика.
До середины прошлого века структура носителей и способы передачи генетической информации оставались неизвестными. Привычная всем модель двойной спирали ДНК была предложена Френсисом Криком и Джеймсом Уотсоном в 1953 году, за что ученые получили Нобелевскую премию. Это стало толчком к открытию генетического кода и разработке ключевых основ молекулярной биологии. В частности, в 1975 году Сенгер и его коллеги предложили «плюс-минус» способ секвенирования ДНК. Первый же полный геном человека расшифровали в 2001 году. После этого момента началась коммерциализация технологий пиросеквенирования, Solexa, лигазного и ионного полупроводникового секвенирования.
Разобравшись с основными принципами функционирования НК , научное сообщество приложило немало усилий для создания методов определения их первичной последовательности. Так, один из грандиозных проектов был реализован в США. Его целью стала расшифровка заложенной в хромосомах генетической информации, которая наследуется от родителей.
Тринадцать лет, несколько миллиардов долларов и множество исследований позволили научным группам открыть широкие перспективы. Теперь появилась возможность находить участки ДНК, связанные с патологиями, передающимися по наследству. Это коснулось не только моногенных, но и многофакторных болезней: онкологий, синдрома Паркинсона и Альцгеймера, сердечно-сосудистых заболеваний. А это в свою очередь расширило способы их прогнозирования, диагностики и последующего лечения у человека, помогло в исследовании этногенеза и популяционной структуры сообществ, эволюционных процессов.
Сегодня этим же целям служит несколько методов секвенирования нового поколения. Все они призваны решать задачи прикладного и фундаментального плана, способствовать ранней диагностике, разработке лекарств и продуктов.
Способы секвенирования нового поколения
На смену методам, предложенным Сенгером, и разработанной Максамом и Гилбертом химической деградации пришли новейшие секвенирующие платформы — секвенаторы. Их важное преимущество — в отсутствии необходимости этапа клонирования фрагментов ДНК, что значительно экономит время. Кроме того, появилась возможность параллельного проведения миллиардов реакций даже в малых объемах, что дало доступ к более обширным данным на выходе.
Наиболее производительным и надежным методом является NGS (next-generation sequencing – секвенирование нового поколения), при котором размер прочитанного фрагмента варьирует в пределах 25–500 пар оснований , что актуально для глубокого и многократного чтения генетического материала. Его создание было обусловлено стремлением к автоматизации анализа, увеличению объема информации и снижению цены исследования. К тому же секвенирование нового поколения позволило одновременно считывать миллиарды коротких фрагментов НК и изучать десятки геномов всего за один запуск секвенатора.
Исследование проходит в три этапа и предполагает подготовку однонитевых библиотек, сам сиквенс и расшифровку полученной информации – интерпретацию биоинформатиками. Ее обработка позволяет определить и описать отклонения от нормального строения ДНК, сравнить мутации с имеющимися базами данных.
Технология секвенирования нового поколения реализуется с использованием нескольких методик:
• Пиросеквенирование — было предложено в 1996 году и предполагает выполнение ряда химических реакций для регистрации пирофосфата. Возможно определение нуклеотидной последовательности фрагментов размером 300–500 пар оснований.
• На молекулярных кластерах — разработана в середине 90-х годов и также основана на синтезе новой молекулы ДНК по матрице. Размер получаемых с секвенатора чтений достигает 300 п. о.
• Циклическое лигазное секвенирование — в основе метод лигирования, предполагающий формирование химических связей между нуклеотидами с помощью фермента лигазы. Цель — определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК размером 25–75 п. о.
• Ионное полупроводниковое секвенирование — исследование выполняется с применением специальных микрочипов, которые регистрируют локальное изменение рН при удлинении синтезируемой цепи ДНК-полимеразой на матрице.
• SMRT — позволил отказаться от ПЦР при пробоподготовке и дал возможность наблюдать в реальном времени за ДНК-полимеразой, наращивающей синтезируемую цепь. Длина чтения значительно увеличилась — до 20 000 п. о.
Применение секвенирования нового поколения
Доступность и высокая производительность NGS вызвала настоящую революцию в медицинской и биологической науке.
Теперь можно проводить ранее технически недоступные исследования и реализовывать такие проекты, как:
• Полногеномный анализ — для развития персонализированной медицины и исследования неизученных вирусов, грибов, животных и растений с прикладными и фундаментальными целями;
• RNA-Seq — для оценки качественной и количественной экспрессии генов. Анализу подвергается работа генома в разных органах, клетках и тканях;
• Метагеномное секвенирование — для изучения бактериального разнообразия в различных средах и образцах;
• ChIP-Seq — для понимания влияния транскрипционных факторов на экспрессию генов, а через нее на физиологические и фенотипические особенности;
• RRBS — для определения метилирования в геноме и его участках;
• Таргетное секвенирование — для сиквенса отдельных участков с целью снижения стоимости эксперимента и увеличения количества анализируемых образцов. Примером может служить HLA-типирование, проводимое при трансплантации, патологиях беременности, аутоиммунных заболеваниях для изучения генов, ответственных за распознавание организмом своих и чужих клеток.
Секвенирование нового поколения заняло важное место в клинической генетике, позволяя улучшить диагностику и процесс лечения пациентов с наследственными заболеваниями в таких областях, как неврология, кардиология, иммунология, офтальмология, нефрология, болезни обмена веществ и др. Ведь оно фиксирует более широкий спектр мутаций по сравнению с методом Сенгера, помогая анализировать даже небольшие замены, инсерции и делеции, инверсии и транслокации. К тому же, можно исследовать последовательность без клинической информации в целях, например, скрининга носительства рецессивных заболеваний.
NGS-панели
Наиболее полные мультигенные панели, в рамках которых методом секвенирования нового поколения (NGS) проводится определение возможных генетических причин различных заболеваний.
Метод NGS активно используется в микробиологии и онкологии. В первом случае секвенирование нового поколения показывает, что представляют собой геномы патогенов, к каким лекарственным средствам чувствительны и как связаны друг с другом, что позволяет отслеживать источник вспышки инфекции. В онкологии благодаря NGS появился шанс на полное изучение генома раковых клеток. А это обеспечивает многие преимущества — от постановки точного диагноза и классификации заболевания до прогноза и выявления причинно-следственных мутаций.
Единственное, что требуется для этого, — соответствующая инфраструктура: кадровый опыт, компьютерная емкость и хранение.
В Центре Генетики и Репродуктивной Медицины Genetico имеется современное оборудование и квалифицированный персонал для проведения секвенирования нового поколения и биоинформатической интерпретации данных. Наша лаборатория находится в Москве, доставка биоматериала возможна из любого города и области России и СНГ. Для вашего удобства проводятся очные и онлайн-консультации .
Список используемой литературы:
Erwin L. van Dijk, Hélène Auger, Yan Jaszczyszyn, Claude Thermes. (2014). Ten years of next-generation sequencing technology. Trends in Genetics. 30, 418-426;
https://dsagsl.org/about/down-syndrome/
F. Sanger, A.R. Coulson. (1975). A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. Journal of Molecular Biology. 94, 441-448;
Zhisong He, Dingding Han, Olga Efimova, Patricia Guijarro, Qianhui Yu, et. al.. (2017). Comprehensive transcriptome analysis of neocortical layers in humans, chimpanzees and macaques. Nat Neurosci. 20, 886-895;
Wang M., Sun X., Yu D., Xu J., Chung K., Li H. (2016). Genomic and transcriptomic analyses of the
Mostafa Ronaghi, Samer Karamohamed, Bertil Pettersson, Mathias Uhlén, Pål Nyrén. (1996). Real-Time DNA Sequencing Using Detection of Pyrophosphate Release. Analytical Biochemistry. 242, 84-89;
Jonas Korlach, Arek Bibillo, Jeffrey Wegener, Paul Peluso, Thang T. Pham, et. al.. (2008). Long, Processive Enzymatic DNA Synthesis Using 100% Dye-Labeled Terminal Phosphate-Linked Nucleotides. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. 27, 1072-1082;
L. Orlando, A. Ginolhac, M. Raghavan, J. Vilstrup, M. Rasmussen, et. al.. (2011). True single-molecule DNA sequencing of a pleistocene horse bone. Genome Research. 21, 1705-1719
Большинство клеток в организме обычно содержат 46 хромосом, организованных в 23 пары. Числовое обозначение имеют 22 хромосомы (1–22). А последняя, 23-я пара хромосом определяет пол человека и имеет буквенное обозначение — XY у мужчин, и XX у женщин.
Как и любой другой документ, экспертизу ДНК можно подделать. Однако, для этого нужно иметь доступ к лаборатории, где проводилась экспертиза, и обладать определенными знаниями и навыками в области генетики и биохимии.
Различают следующие виды ДНК: сцДНК (свободно-циркулирующая ДНК), мтДНК (митохондриальная ДНК, которая представляет собой кольцевую двухцепочечную молекулу ДНК, которая присутствует в митохондриях в виде ковалентно замкнутой суперспирализованной формы, ассоциированной с внутренней мембраной митохондрии), триплекс-ДНК (форма ДНК, в которой три олигонуклеотида обвивают друг друга, формируя тройную спираль).
